Western及IP细胞裂解液 Ver.760958-2.0
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货号
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产品名称
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规格
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WL1020
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Western及IP细胞裂解液
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100 ml
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● 产品简介：
Western及IP细胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP)，是一种在非变性条件下裂解细胞的裂解液。本细胞裂解液裂解的细胞，可以用于PAGE，Western，免疫沉淀(immunol precipitation，IP)和免疫共沉淀(Co-IP)。裂解液的主要成分为20 mM
Tris (pH7.5)，150 mM NaCl，1% Triton X-100，EDTA等，裂解后能维持原有的蛋白间相互作用。由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不能用传统Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：RTP7102）或Bradford蛋白浓度测定试剂盒（去垢剂兼容型）（货号：RTP7104）测定蛋白浓度。
● 贮存、运输及效期：
-20℃保存，湿冰运输，有效期一年。
● 注意事项：
1.为取得最佳的使用效果，尽量避免过多的反复冻融。可以适当分装后使用。
2. 需自备PMSF或其他蛋白酶抑制剂；如进行蛋白磷酸化研究，还需要自备磷酸酶抑制剂。
3. 裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。
● 使用说明：
1. 准备裂解液：
溶解裂解液，混匀；取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入1/100体积的100 mM PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mM。如进行蛋白磷酸化研究，需要加入磷酸酶抑制剂。
2. 细胞蛋白提取：
2.1 贴壁细胞：去除培养液，加入适量1×PBS，轻柔漂洗一遍，不要扰动贴壁细胞。按照6孔板每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，冰上裂解细胞5分钟，用细胞刮刀刮下细胞收集于1.5 ml离心管中，冰上继续裂解15分钟，间歇混匀。
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培养板规格/培养皿表面积
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细胞量
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裂解液推荐使用量
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100 mm培养皿
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1.5×107
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0.5-1 ml
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60 mm培养皿
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5×106
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0.25-0.5 ml
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35 mm培养皿
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2×106
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0.2-0.4 ml
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6孔板
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2.5×106
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100-200 μl
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24孔板
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5×105
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100-150 μl
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96孔板
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1×105
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50-100 μl
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2.2 悬浮细胞：450 g
4℃ 离心5 min收集细胞；用适量1×PBS重悬细胞，450 g 4℃ 离心5 min收集细胞；重复漂洗细胞一次；按照细胞沉淀体积（PCV）20 μl加入200 μl 裂解液，混匀细胞沉淀，冰浴处理15分钟，间歇混匀。注：2×106 Jurkat细胞，其细胞沉淀体积（PCV，Packed Cell Volume）大约为20 μl。
2.3 裂解细胞：
通过强烈涡旋震荡使样品裂解充分，冰浴处理15分钟。如果出现絮状物质，为释放出的核酸，可以用超声破碎打断核酸。注：如果进行Co-IP实验，裂解混合物不建议使用超声波破碎仪处理，因为超声波处理比较剧烈，容易破坏蛋白的相互作用。
2.4 离心收集上清：
4℃ 16000 g离心10分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
3. 组织样品蛋白提取：
3.1 手术切除的组织块迅速置于预冷的生理盐水中，漂洗数次，洗净组织血迹，用滤纸吸干组织表面液体，将组织切成细小的碎片。
3.2 按照每20 mg组织加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)
3.3 用玻璃匀浆器冰浴匀浆5-10次，收集匀浆后的裂解混合物，冰浴处理15分钟。
注：如果出现絮状物质，为释放出的核酸，可以用超声破碎打断核酸。如果进行Co-IP实验，裂解混合物不建议使用超声波破碎仪处理，因为超声波处理比较剧烈，容易破坏蛋白的相互作用。
3.4 充分裂解后，4℃ 16000 g离心10分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
实验示例：
不同裂解液提取细菌和细胞的总蛋白电泳图
凝胶：4-18% Tris-甘氨酸预制胶（RTD6119）
样品1制备：2 ml K562细胞（6.5×106/ml），3000rpm 5min，
沉淀用PBS清洗2次，离心后彻底去除PBS，加入130 μl超纯水，100 μl
5×loading buffer(变性，还原)，95度10 min，上样5 μl和10 μl。
样品2制备：2 ml 4K细菌细胞（O/N培养），13000 rpm 5min，
离心后彻底去除残余液体，加入130 μl超纯水，100 μl 5×loading buffer，
95度10min，上样7.5 μl。
样品3-9：1 ml K562细胞（6.5×106/ml），3000 rpm 5 min，
沉淀用PBS清洗2次，离心后彻底去除PBS，加入200 μl各种裂解缓冲液，
冰浴15 min，间歇漩涡震荡40秒（样品9加超声处理2 min），
13000 rpm低温离心10 min，取上清即为总蛋白。加入5×loading buffer(变性,还原)
调整样品浓度为0.2 μg/μl，95度10min，上样10 μl。