单链RNA Marker（100-1000 nt）                       Ver.760354-1.0

● 产品组成：

● 产品简介：

单链RNA  Marker（100-1000 nt）由不同长度体外转录的6条单链RNA分子混合而成，长度分别为100，200，300，400，600，1000 nt，适用于 RNA 常规凝胶电泳。样品保存在 TE缓冲液中，每条带浓度约为500 ng/μl（配成即用型RNA Marker后，每条带的浓度约为250 ng/μl）。使用前与等体积2×RNA上样缓冲液混合即可上样电泳。

该Marker适用于非变性琼脂糖电泳，甲醛变性琼脂糖电泳以及TBE尿素变性PAGE电泳，电泳后可以使用核酸染料如RealSafe Red（货号：GR002）或RealSafe All（货号：GR004）染色，均可以得到清晰的条带分离效果。

产品内附带2×RNA上样缓冲液 (尿素变性胶，RNase-free)。以每次上样5 μl计算，混合好的单链RNA Marker可以使用大约20次。

●  贮存、效期及运输：

-20℃贮存；有效期1年；湿冰运输。

● 注意事项：

1. ssRNA Marker 与普通 RNA 一样极易被 RNase 降解，因此实验时请戴好手套、口罩，实验的仪器及溶液应经 DEPC 处理，凝胶及电泳缓冲液应现用现配。操作过程中须严格注意避免RNase污染，并尽量减少RNA Ladder暴露于空气中的时间，取用后立即盖上盖子。

2. 建议单链RNA Marker现用现配，因为混合有上样缓冲液的单链RNA稳定性不好。

3. 本产品用作单链RNA的分子量标准时，不建议用于精确确定RNA长度，因为RNA中不同核苷酸的组分也会对电泳迁移率产生一定的影响。

● 使用方法：

一. 普通非变性琼脂糖凝胶电泳：

1.1取 2.5 μl ssRNA Marker加 入 等 体 积 2× RNA上样缓冲液并 混 匀， 然 后 70 ℃ 加 热 5 min， 迅 速 转 移 至 冰 上 冷 却 3 min；样品需和 ssRNA Marker 进行相同的处理，可通过RNase-free水稀释样品并补加 2× RNA上样缓冲液调整体积；

1.2 配制 2% 或更高浓度的 TBE 琼脂糖凝胶并电泳；

1.3 将电泳完成的凝胶进行染色并拍照。

二. 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳：

2.1 配制50 ml 2%甲醛变性琼脂糖凝胶：称取1 g琼脂糖加入36 ml RNase-free水中，加热融化后，加入5 ml 10×MOPS Buffer（200 mM MOPS，50 mM 醋酸钠，10 mM EDTA，pH7.0），待溶液冷却至不烫手时（约60℃），加入9 ml 37% 甲醛溶液（在通风橱中操作），轻柔混匀（透光观察无油状物）后倒胶，常温凝胶 30~60 min；

2.2 ssRNA Marker和样品处理方式与普通非变性琼脂糖凝胶电泳一致；

2.3 将琼脂糖凝胶放入电泳槽，在电泳槽中加入1×MOPS Buffer至没过凝胶，10 V/cm 条件下预电泳10 min；

2.4上样，5~10 V/cm 条件下电泳至溴酚蓝迁移至胶的 2/3 左右位置，电泳过程中应每隔 10~20 min 混匀电泳槽中的电泳液一次；

2.5电泳结束后，将凝胶在RNase-free水中浸泡 15 min，除去凝胶中的甲醛；

2.6 染色20~30 min（避免染色过久导致 RNA 降解），拍照。

三. TBE-尿素PAGE电泳：

注：以下使用方法均以8×10 cm凝胶 厚1.0 mm示例，其他规格凝胶请适当调整。

3.1凝胶制备：

3.1.1 可以选择RNA尿素PAGE电泳试剂盒（Cat：RTE4103））或按照以下程序制胶。

3.1.2凝胶配制：将不同体积的成分混合，漩涡搅拌至尿素彻底溶解。

TBE-尿素PAGE凝胶配方表 (总体积7 ml，适用于厚度1.0 mm小板胶)

1.3在凝胶玻璃板中灌入凝胶溶液至前玻璃板顶端，插入梳子。

1.4常温静置30-60分钟，等待浓缩胶聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

3.2 样品制备：

取适量体积单链RNA Marker样品与等体积的2×RNA上样缓冲液 (尿素变性胶，RNase-free)混合，70℃处理5分钟，冰浴制冷后待上样。待测样品也需要进行同样处理。

3.3 电泳：

3.3.1. 预电泳（可选）：电泳槽内外加入适量1×TBE缓冲液稳压200 V预电泳30分钟。电泳结束后，用1×TBE缓冲液彻底冲洗加样孔2-3次，去除残余的尿素。

3.3.2上样：根据梳齿确定Marker上样量， 一般是10齿1 mm厚梳子Marker上样5 μl，15齿1mm厚梳子上样3 μl。

3.3.3 连接电源线，打开电源开关，按照以下条件电泳。

注：恒压下电泳，电流是逐渐降低的，不用调节，记录电流变化数值。

3.3.4 等待上样缓冲液的溴酚蓝指示前沿到凝胶底部时终止电泳，取出凝胶进行后续实验。

注：在5%TBE-尿素胶中，溴酚蓝指示前沿位置大约相当于40 nt RNA片段的位置。

3.4 染色：

单链RNA推荐用RealSafe Red（货号：GR002）或RealSafe All（货号：GR004）染色，两种染料均可以得到清晰的条带分离效果。

注：其余染料如GelRed，Goldview，EB等染色效果不好。

● 实验示例：

一.  2%非变性琼脂糖凝胶电泳结果： 

二.  5%TBE-尿素PAGE电泳结果：