昆虫基因组DNA提取试剂盒

Insect Genomic DNA Isolation Kit

● 试剂盒内容及保存：

● 储存条件和效期：

室温保存，12个月内有效。缓冲液IL与缓冲液 IB可能有沉淀产生，37℃水浴溶解后即可。RNase A和蛋白酶K常温运输，-20℃保存。

● 产品简介：

该试剂盒采用独特的裂解液能够有效除去多糖多酚等，能够从昆虫、软体动物、节肢动物、蛔虫等样品中提取DNA，保存在醇类的样品也适用于本试剂盒的提取。一次操作可以处理小于50mg组织，样品经裂解液消化，氯仿分离除去大部分的多糖多酚，再经分离柱进一步纯化，便可得到高纯度的DNA。所得的DNA可以用于PCR，Southern杂交，酶切消化等实验。

● 准备工作：

1. 准备65℃水浴；无水乙醇；制冰机；1.5ml离心管；2ml离心管

2. 按照标签所示在缓冲液IB中加入异丙醇，在DNA Wash Buffer和缓冲液WB中加入无水乙醇，混匀后盖紧瓶盖后常温贮存备用。

3. 每次使用前请检查缓冲液IL，缓冲液IB是否有沉淀生成，如果出现沉淀，37℃温浴至沉淀溶解后再使用。

● 标准操作步骤：

如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在常温下离心。

1. 液氮充分研磨样品。

2. 收集研磨成粉末的50 mg样品，置于1.5ml离心管中。

3. 加入350 μl65℃预热的缓冲液 IL，并加入20 μl 蛋白酶K剧烈地漩涡振荡，确保所有的组织团都分散均匀。

4.65℃水浴20-30min。水浴期间颠倒样品数次。

5. 加入300 μl缓冲液LF，充分混匀，12,000 rpm (~13,400×g )  离心5分钟。

6. 小心地把上清液吸至另一新的1.5ml离心管中。注意确保不要打散沉淀团或把组织碎片也一起转移。 

7. 加入4 μl RNase A，涡旋混匀。常温放置2min。

8. 加入等体积的缓冲液 IB（请确保已经按照标签加入异丙醇），充分混匀。如：向300μl上清中加入300 μl 缓冲液 IB。  

9. 把上述混匀的液体转移到吸附柱CG上。10,000×g离心1 min以结合DNA，弃去滤出液体。纯化柱最大容量为750 μl,如果混合液大于750 μl,请分两次过柱。 

10. 将吸附柱重新套回收集管中，加入500μl 缓冲液WB（请确保已经按照标签加入无水乙醇）至柱子中，10,000×g离心1min,倒弃流出液；

11. 将吸附柱重新套回收集管中，加入600μl DNA Wash Buffer（请确保已经按照标签加入无水乙醇）至柱子中，10,000×g离心1min,倒弃流出液；

注意：DNA Wash Buffer使用前须按要求用无水乙醇稀释。如果放入冰箱中，使用前须恢复到室温。 

12.再加入600 μl DNA Wash Buffer（请确保已经按照标签加入无水乙醇）至柱子中，8,000×g离心1min,弃去流出液；

13. 将吸附柱重新套回2ml收集管中，最大转速（>13000×g）离心空结合柱1min以干燥柱子的基质；这一步对下面的洗脱步骤至关重要。 

14. 将柱子置于1.5 ml灭菌离心管，加入50-150 μl  65℃预热的洗脱缓冲液EB至柱子的膜中央。常温静置5 min； 

15. 常温下，离心(>13000g)1min，以洗脱DNA。保留含DNA的流出液。将DNA储于-20℃。

● DNA浓度及纯度检测：

基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。提取的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。可配制0.8-1.0％琼脂糖凝胶，使用λ/HindIII判断基因组的大小，完整的基因组大小应在23 kb以上。使用分光光度计检测时， OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7–1.9之间，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水洗脱，比值可能偏低，但并不表明DNA纯度不高。