真菌基因组DNA提取试剂盒（目录号：RTG2407）
● 试剂盒内容及保存：
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试剂盒组成
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RTG2407
（50次）
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贮存方式
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缓冲液C1
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40 ml
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常温
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缓冲液C2
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12 ml
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常温
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缓冲液C3
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20 ml
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常温
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漂洗缓冲液WB1
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30 ml
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常温
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DNA Wash
Buffer (浓缩液)
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13 ml
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常温
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洗脱缓冲液EB
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15 ml
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常温
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RNaseA
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220 μl
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-20℃
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吸附柱CG
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50个
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常温
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收集管（2
ml）
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50个
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常温
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说明书
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1份
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● 储存条件和效期：
室温保存，24个月内有效。Buffer C2于Buffer C3可能有沉淀产生，37℃水浴溶解后即可。RNase A常温运输,-20℃保存。
● 产品简介：
该试剂盒采用简便的硅胶柱结合纯化方式和独特的溶液处理系统，可在60分钟内可处理多个100mg新鲜或30mg干燥真菌组织样品。独特的缓冲液与硅胶柱可以有效的去除组织裂解物种的多糖，酚类，以及酶抑制物。该试剂盒提取到的DNA可以用于PCR，Southern杂交，酶切消化等实验。无需使用酚氯仿等有机，可以同时进行多个样品的处理。
● 准备工作：
1. 准备65℃水浴；无水乙醇；异丙醇；制冰机；1.5ml离心管；2ml离心管
2. 按照标签所示在漂洗缓冲液PW中加入无水乙醇，混匀后盖紧瓶盖后室温贮存备用。
3. 每次使用前请检查缓冲液R2，缓冲液R3是否有沉淀生成，如果出现沉淀，37℃温浴至沉淀溶解后再使用。
● 标准操作步骤：
如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
1.样品的处理：
A．新鲜样品：新鲜样品可以用液氮研磨成粉末。或者在45℃烘箱下过夜来干燥后按干燥样品进行操作。
B．干燥样品：用研钵或研磨研杵研磨成粉末。
2. 小于100mg新鲜样品或者小于20mg干燥样品，加入600μl Buffer C1及4μl
RNase A涡旋混匀。
3.65℃水浴10分钟。孵育过程中短暂涡旋管子几次。
4. 加入150μl Buffer C2，颠倒振荡混匀,冰上放置1分钟后10,000×g下离心3min。 （离心后应分层，如还有漂浮物，请延长离心时间）。
5. 小心地把上清液吸至另一新的小离心管中。注意确保不要打散沉淀团或把组织碎片也一起转移。
6. 加入二分之一上清体积的 Buffer C3与与等体积的无水乙醇，充分混匀。如：向300μl
上清中加入150μl Buffer C3与300μl无水乙醇。
7. 把上述混匀的液体转移到分离柱上。10,000×g离心1
min以结合DNA，弃去滤出液体。纯化柱最大容量为750μl,如果混合液大于750μl,请分两次过柱。
8. 将GBC吸附柱重新套回收集管中，加入600μl
DNA Wash Buffer（使用前须按要求用无水乙醇稀释）至柱子中，10,000×g离心1min,倒弃流出液；
9.再加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，8,000×g离心1min,弃去流出液；
10. 将吸附柱重新套回2ml收集管中，最大转速（>13.000xg）离心空结合柱1min以干燥柱子的基质；这一步对下面的洗脱步骤至关重要。
12. 将柱子置于1.5ml灭菌离心管，加入50-150μl65℃预热的T洗脱缓冲液EB至柱子的膜中央。室温静置5min；
13. 室温下，离心(>13000g)1min，以洗脱DNA。保留含DNA的流出液。将DNA储于-20℃。
对低DNA含量的样品按如下操作：
1. 收集研磨成粉末的植物组织，新鲜组织约400mg（干燥组织约200mg），置样品于15ml离心管中。
2. 加入9ml Buffer C1，剧烈地漩涡振荡。
3.65℃水浴30-60min。水浴期间颠倒样品数次。
4. 加入2.5ml Buffer C2，充分混匀，3000×g离心10分钟。转移上清到新的15ml离心管中，加入0.7倍的异丙醇，3000×g离心10分钟。
5. 倒掉上清，加入300μl的灭菌去离子水与5μl RNaseA。65℃水浴溶解DNA。
6. DNA完全溶解后，加入150μl Buffer C3与300μl无水乙醇。
7. 按标准操作步骤的第七步，继续往下操作。
● DNA浓度及纯度检测：
基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。提取的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。可配制0.8-1.0％琼脂糖凝胶，使用λ/HindIII判断基因组的大小，完整的基因组大小应在23kb以上。使用分光光度计检测时， OD260/OD280比值应为1.7–1.9之间，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水洗脱，比值可能偏低，但并不表明DNA纯度不高。
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常见问题
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可能原因
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建议
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堵柱子
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转移裂解上清时，转移了沉淀
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按说明书操作，氯仿分离后，确保不转移到沉淀
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样品太粘稠
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样品量别超过说明书上所说的，或者增加 Buffer C1 的用量。
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低浓度的DNA量
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样品的破壁方式不对
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不论新鲜还是干燥样品，在加入 Buffer C1 之前必须用适当方式的研磨成粉末。
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样品的裂解效果不好
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减少样品量，或者增加Buffer C1的用量。
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DNA残留在柱子上
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增加洗脱液的用量，并在离心洗脱前65℃孵育5min。
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DNA洗涤不当
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DNA
Wash Buffer按说明书用无水乙醇稀释。
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下游应用不好
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提取的DNA含盐量高
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DNA
Wash Buffer如果必须按要求用无水乙醇稀释，必须室温放置。
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提取的DNA含有乙醇
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洗脱前，必须最高转速空甩柱
子1min。
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● 常见问题分析：
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常见问题
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可能原因
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建议
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没有洗脱出DNA
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加入缓冲液R5后没有加入无水乙醇
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样品过柱前，必须用无水乙醇调整核酸结合条件，否则核酸不能挂柱。
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漂洗缓冲液WB2中没有加入乙醇
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漂洗缓冲液WB2使用前请按照标签加入无水乙醇。无水乙醇加入量不正确会导致核酸提取量大大降低。
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低浓度的DNA量
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缓冲液R2使用过量
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按照步骤1加入适量缓冲液R2
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洗脱体积太小
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洗脱体积不能低于50μl，如洗脱体积太小，回收率将大大降低。
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洗涤不恰当
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漂洗缓冲液PW使用前请按照标签加入无水乙醇。无水乙醇加入量不正确会导致核酸提取量大大降低。
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低A260/A280比率
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蛋白污染
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不要忽略步骤8中用漂洗缓冲液WB1冲洗吸附柱
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洗脱液pH值不合适
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确保使用的洗脱液pH在8.0以上，如低于8.0将导致DNA洗脱量过低。
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下游应用不好
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提取的DNA含盐量高
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漂洗缓冲液WB2使用前请按照标签加入无水乙醇。
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提取的DNA含有乙醇
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步骤11空甩柱子2分钟非常关键，彻底去除漂洗液中的乙醇。
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抑制PCR反应
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增加缓冲液R2用量，彻底去除腐殖酸等PCR抑制因子；步骤4中确保不要吸取到沉淀。
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RTG2407 真菌基因组DNA提取试剂盒发表文章
1. [2021 IF=6.064] Genome resequencing and transcriptome
analysis reveal the molecular mechanism of albinism in Cordyceps militaris.
Author: Ying Zhao, YuDong Liu, Xun Chen and Jun
Xiao
Product: RTG2407 真菌基因组DNA提取试剂盒
Journal: Fronties in
Microbiology. Published 11 April 2023
Institution： Institute of Edible Fungi, Liaoning
Academy of Agricultural Sciences
Paper link：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1153153/full