动物核蛋白与胞浆蛋白提取试剂盒

        Animal Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit    Ver 20260127-2.0

● 产品简介：

在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。分离核蛋白和胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称gel shift)，footprinting等。动物核蛋白与胞浆蛋白提取试剂盒提供了一种比较简单方便地从组织和培养细胞中抽提细胞核蛋白与胞浆蛋白的方法。约90分钟就可以完成细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等实验。

本试剂盒是通过抽提试剂A与抽提试剂B协同作用，破坏细胞膜，释放出胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核；再用高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到核蛋白。一般情况下，胞浆蛋白与核蛋白之间的交叉污染低于10%。提取得到的胞浆蛋白含有非离子去垢剂，保持了蛋白活性；提取得到的核蛋白为可溶性核蛋白（不包括核膜蛋白和核骨架蛋白），不含去垢剂，由于盐离子浓度较高，可能需要脱盐或稀释后用于相关实验。

对于细胞样品，如果细胞数量在二百万（2×10⁶），本试剂盒可以抽提50个样品；对于组织样品，如果每个样品重量为20毫克，本试剂盒可以抽提50个样品。

● 产品组成：

● 贮存、效期及运输：

-20℃贮存；有效期一年；试剂盒湿冰运输。

● 用前必读：

1. 离心机请调整成RCF/g模式，按照离心力设置离心机（不要根据转速rpm模式设置），所有离心步骤都需要在4℃低温离心机中进行。

2. 蛋白提取推荐添加蛋白酶抑制剂如100 mM PMSF（100×）（自备，试剂盒不提供），添加时按照1:100添加。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制剂（自备，试剂盒不提供）。

3. 蛋白定量推荐使用BCA方法，可以选择BCA蛋白浓度测定试剂盒。

●  使用方法：

一. 实验步骤：

1.1准备溶液：常温溶解试剂盒中的试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和细胞核蛋白抽提试剂，在使用前加入PMSF溶液（使得PMSF终浓度为1 mM）和/或磷酸酶抑制剂（自备，试剂盒不提供），随后立即放于冰上待用。

1.2 准备细胞：

1.2.1 对于贴壁细胞：用PBS漂洗一遍，弃PBS；再加入适量PBS，用细胞刮刀刮下细胞，或用0.02% EDTA（0.5 mM）溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。450 g 4℃离心5 min收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。

1.2.2 对于悬浮细胞：450 g 4℃离心5 min收集细胞，用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

1.3 按照下表大体估算提取溶液使用体积：

注：(二百万，2×10⁶)HeLa细胞，其细胞沉淀体积（PCV，Packed Cell Volume）大约为20 μl。

1.4 胞浆蛋白提取：

1.4.1细胞沉淀中加入准备好的200 μl细胞浆蛋白抽提试剂A（确保已添加蛋白酶抑制剂），用1 ml吸头吹打重悬细胞沉淀5-10次，把细胞沉淀完全悬浮并分散开,冰浴5分钟。

1.4.2 关键步骤：加入10 μl 细胞浆蛋白抽提试剂B（按照细胞浆蛋白抽提试剂A体积的1/20加入），混匀，冰浴10分钟。

        注：此步骤尽量不要漩涡震荡沉淀，否则得到的细胞浆蛋白可能会污染核蛋白。

1.4.3 4℃ 16000g 离心5分钟，取80%上清即为胞浆蛋白，保存备用。

     注：吸取上清时千万不要触及沉淀，可以只取80%体积上清，以免胞浆蛋白中污染细胞核。每2×10⁶细胞用200 μl细胞浆蛋白抽提试剂A裂解后获得的上清，其细胞浆蛋白浓度约为1-2 μg/μl，不同细胞略有不同。

1.5 细胞核蛋白提取：

注：此步骤使用细胞核蛋白抽提试剂（高盐缓冲液）使得细胞核收缩，核酸结合蛋白（如转录因子）与核酸分离，扩散到细胞核外部，离心后上清中为可溶性非变性（活性）核蛋白，适用EMSA，转录因子活性分析等实验。

1.5.1彻底去除步骤1.4.3离心管内上清，沉淀中再次加入200 μl细胞浆蛋白抽提试剂A（含PMSF），用1 ml吸头吹打重悬沉淀至沉淀完全散开（注：涡旋震荡不易悬浮沉淀），冰浴5分钟；4℃ 16000 g 离心5分钟，彻底去除上清，沉淀即为完整的细胞核。

注：此步骤目的是彻底漂洗沉淀中残余的未裂解细胞，可以大大提高细胞核的纯度；上清必须彻底去除干净，否则会导致细胞核蛋白中污染胞浆蛋白。

1.5.2 沉淀中加入100 μl细胞核蛋白抽提试剂（确保已经添加PMSF），吸头重悬沉淀，4℃旋转混匀30 min，至最后得到的溶液无可见悬浮物。

       注：如不能旋转混匀，可以冰浴30 min，每隔5分钟涡旋混匀一次。

1.5.3 4℃16,000 g离心10分钟，立即吸取上清至一预冷的离心管中，即为抽提得到的活性核蛋白。可以立即使用，也可以-80℃冻存。每2×10⁶细胞提取的细胞核蛋白浓度约为1-3 μg/μl（可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒定量），不同细胞略有不同。

1.6对于新鲜组织：

1.6.1 组织匀浆（关键步骤）：

把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照 20:1 的比例混合细胞浆蛋白抽提试剂A和B(例如 200 微升细胞浆蛋白抽提试剂 A 中加入 10 微升细胞浆蛋白抽提试剂 B)，并加入 PMSF 至终浓度为 1 mM 配制成组织匀浆液。按照每 20 mg 组织加入大约200 微升组织匀浆液的比例在1 ml玻璃匀浆器内冰浴充分匀浆5-10次。 鉴定方法：取10 μ l匀浆5次后的组织样品，加入等体积的台盼蓝染色液，混匀，在显微镜下观察台盼蓝溶液染色阳性（蓝色）细胞数目的比例，当阳性（蓝色）细胞破碎达到50%即可停止匀浆，请勿过度匀浆。若阳性（蓝色） 细胞比例未达到50%，适当增加1-2次匀浆，随后按照同样的方法使用台盼蓝溶液进行鉴定。

1.6.2 组织裂解：

匀浆后把匀浆液转移到离心管内，冰浴放置15分钟，间歇混匀或者4℃旋转混匀15 分钟。

1.6.3提取组织细胞浆蛋白：

4℃ 16000 g 离心5分钟，取80%上清即为胞浆蛋白，保存备用。

注：吸取上清时千万不要触及沉淀，可以只取80%体积上清，以免胞浆蛋白中污染细胞核。

1.6.4 组织细胞核蛋白提取：

彻底去除步骤1.6.3中的上清，得到的沉淀按照步骤1.5进行。新鲜的肝脏组织用本产品裂解后获得的上清，其细胞浆蛋白浓度约为1-5 μg/μl，细胞核蛋白浓度约为1-5 μg/μl，不同状态的不同组织有所不同。

二 关于胞浆蛋白和核蛋白产量和质量的评价：

2.1蛋白产量：

2.2 胞浆蛋白和核蛋白质量评价：

蛋白分区提取的质量评价首先看提取的蛋白是否是分区蛋白，其次要看分区蛋白是否有明显的富集，其三要看提出的分区蛋白是否有其他组分交叉污染，最后看提取的分区蛋白中是否可以检测出目的蛋白。使用专门的胞浆内参和细胞核内参（下表），可以初步确认提出的是胞浆蛋白还是核蛋白。蛋白是否有效富集需要用总蛋白作为对照，与总蛋白相比，胞浆蛋白内参或核内参是否有明显富集。交叉污染可以用其他组分内参检测蛋白样品，如关注胞浆蛋白中是否有细胞核蛋白污染，可以使用核蛋白内参如Lamin B1检测胞浆蛋白，检测无条带即说明胞浆蛋白与细胞核组分无交叉污染。用目标蛋白抗体检测分区蛋白，验证是否可以检测到目的蛋白，蛋白大小是否符合预期。

三. 实验示例：

3.1 K562细胞台盼蓝染色：

3.2 K562细胞核浆分离WB检测：

Jurkat总蛋白，细胞浆蛋白，细胞核蛋白GAPDH检测

总蛋白提取：4×10⁶ K562细胞，400 g 离心收集，去上清，沉淀中加入200 μl RIPA（加2 μl 100 mM PMSF），冰上裂解5分钟，4℃ 16000 g 15 分钟，上清即为总蛋白（TP）。

细胞浆蛋白：4×10⁶ K562细胞，400 g 离心收集，加入400 μl细胞裂解缓冲液A （加4 μl 100mM PMSF，加0.4 μl 1 M DTT），悬浮沉淀，冰浴5分钟；加入20 μl细胞裂解缓冲液B，混匀，冰上孵育5分钟，4℃ 16000g 5分钟，小心收集上清即为细胞浆蛋白（CP），不要触及沉淀。

细胞核蛋白提取：沉淀中计入100 μl核蛋白提取试剂I（变性），1 μl Benzonase，37℃ 30 min，4 ℃ 16000 g 10分钟，上清即为细胞核蛋白（NP）。

电泳：RTD6117-0420  200V 33-12 mA 55 min

转膜：NC膜，1×RealBlot快速转膜液湿转，稳流400 mA，电压变化64-57 V，转膜时间35 min

封闭：无蛋白快速封闭液RT 10 min

一抗孵育；二抗孵育；检测：ECL发光检测